一、产品概述

　　(一)产品主要组成成分

　　表1.产品主要组成成分

　　(二)产品预期用途

　　本试剂盒用于体外定性检测人血清中游离DNA(cfDNA)中的BMPR1A和PLAC8基因甲基化水平。

　　本产品适用于临床上对疑似原发性肝细胞癌、混合型癌的辅助诊断，包括临床肝区影像学检查和既有临床检查怀疑肝区占位性病变的患者，检测结果阳性不作为肝癌临床确诊的唯一依据，检测结果阴性也不能排除肝癌的可能。该检测不能作为肝癌早期诊断或确诊的依据，不宜用于普通人群的肿瘤筛查。

　　(三)产品包装规格

　　24人份/盒、48人份/盒。

　　(四)产品检验原理

　　提取血清中的游离DNA，然后用亚硫酸盐转化在机体内未发生甲基化的胞嘧啶，通过脱氨基反应产生尿嘧啶磺酸盐，在机体内已经发生甲基化的胞嘧啶不会被亚硫酸盐转化。将亚硫酸盐转化的DNA做数字PCR扩增，反应中的引物探针能区分靶基因甲基化和非甲基化序列。应用数字PCR对甲基化和非甲基化微滴进行检测，读取FAM与HEX荧光通道下产生荧光的液滴数量。使用生成的靶基因甲基化和非甲基化微滴数量计算甲基化率，根据甲基化率判断样本的阴阳性。

二、临床前研究概述

　　(一)主要原材料

　　1.主要原材料的选择

　　该产品的主要原材料包括预混液、引物和探针、肝癌细胞系(Huh-7)基因组DNA 和正常细胞系(WBC)基因组DNA。这些原料均是通过外购的方式获得。其中引物的序列均由申请人自行设计，由合成公司经过合成、修饰、纯化方式获得;预混液由供应商化学合成、克隆表达后获得;肝癌细胞系(Huh-7)基因组DNA和正常细胞系(WBC)基因组DNA 由供应商提取纯化获得。

　　申请人对主要原材料进行了供应商的选择，通过功能性实验筛选出合格供应商，制定了各主要原材料的技术要求和质量标准并经检验合格。

　　2.企业参考品和质控品设置情况

　　该产品企业参考品包括阳性参考品、阴性参考品、最低检测限参考品和精密度参考品。

　　企业参考品包括BMPR1A基因和PLAC8基因相应位点甲基化阳性和阴性的样本，甲基化状态均经过甲基化特异性数字PCR和测序的方法验证。

　　阳性企业参考品包括6种，分别命名为阳性参考品P1-P6，由不同浓度的肝癌细胞系(Huh-7)基因组DNA和正常细胞系(WBC)基因组DNA按不同甲基化比例混合的样本。

　　阴性企业参考品包括7 种，分别命名为阴性企业参考品N1-N7，N1-N3为不同浓度的正常细胞系(WBC)基因组DNA样本;N4-N6 为分别掺入不同干扰物质的正常细胞系(WBC)基因组DNA样本;N7为一定浓度的含有其他不同肿瘤相关的基因甲基化的样本。

　　最低检测限参考品有1种，命名为L，为一定浓度的低甲基化比例的混合样本。精密度企业参考品包括2种，分别命名为精密度企业参考品J1、J2。J1为一定浓度的高甲基化比例的混合样本，J2为一定浓度的低甲基化比例的混合样本。

　　该产品设置了阳性质控和阴性质控，用于检测过程中试剂盒和仪器的质量控制。此外，每个样本均检测2个内部质控，用于结果的判读和评估样本的质量。

　　(二)生产工艺及反应体系研究

　　申请人对该产品反应体系的研究包括引物探针浓度的确定、预混液的选择、阴/阳性质控品的确定等;对PCR反应条件的研究包括退火温度及时间、循环数等;对样本的用量以及样本保存时间进行了研究。

　　通过功能性实验，最终确定了最佳反应体系。申请人根据试剂盒中试剂及组件的主要生产工艺的研究结果，确定了最佳的生产工艺。

　　(三)分析性能评估

　　该产品分析性能评估内容包括：准确性(阳性符合率、阴性符合率)、精密度、检测限、分析特异性的评估;核酸提取试剂的性能研究。

　　准确度研究使用三批试剂盒对若干临床血清样本(高甲基化率、低甲基化率阳性样本及甲基化率阴性样本)进行检测，试剂盒检测结果与测序结果阳性符合率和阴性符合率均为100%。精密度研究使用精密度企业参考品和临床样本混合的阴性样本和阳性样本，使用三批试剂盒对样本进行检测。对三批试剂盒的批次内/间、日内/日间(20天)、操作者间及不同实验室间的精密度进行评价。研究结果显示，试剂盒对BMPR1A和PLAC8基因甲基化水平检测变异系数不大于10%。

　　最低检测限研究中，申请人使用不同甲基化比例的样本，每浓度梯度使用三批试剂盒检测20次，将检出率大于等于95%的最低浓度水平确定为最低检测限。使用三批试剂盒对不同甲基化比例的临床样本进行最低检测限的验证。

　　分析特异性研究包含交叉反应研究和干扰研究，交叉反应研究包括结肠癌基因组DNA(含SDC2基因)及其他常见甲基化基因(包含BCAT1、NDRG4、SEPTIN9、BMP3、RNF180、SOX17基因)、其它消化道肿瘤(包含食道癌、胰腺癌、胃癌、肠癌、胆管癌)、良性肝病(包含重度肝硬化失代偿期)、自身免疫性疾病样本等，结果显示均无交叉反应。同时，申请人对甲基化转化前后的样本进行研究，结果显示，该产品仅能特异性的对甲基化转化后样本中BMPR1A基因和PLAC8基因的甲基化水平进行有效的检测。

　　干扰研究结果显示，样本中含有以下干扰物：胆红素(0.2mg/mL)、胆固醇(5mg/mL)、葡萄糖(10mg/L)、甘油三酯(12mg/mL)、尿酸(0.235mg/mL)、红细胞(0.4%,v/v)，血红蛋白(10mg/mL)和血清白蛋白(40mg/mL)，以及常见肝病药物，包含嗯替卡分散片(0.0015mg/mL)、护肝片(2.1mg/mL)、联苯双脂滴丸(0.015mg/mL)、胱氨酸片(0.15mg/mL)、复方甘草酸苷片(0.1125mg/mL)、甘草酸二铵胶囊(0.225mg/mL)，对检测结果均无影响。

　　申请人对核酸提取试剂盒性能进行研究，并根据与该产品的组合性能研究结果，确定推荐的核酸提取试剂符合检测要求。

　　(四)阳性判断值研究

　　申请人对该产品阳性判断值的研究采用临床来源的血清样本。阳性判断值研究入组(包含建立和验证)样本数共计1998例，包括肝细胞癌、肝细胞癌-肝内胆管癌(混合型癌)、良性肝脏疾病、其他肿瘤样本等。对五种不同的判读方法的灵敏度和特异性、肝癌分期、阴性样本进行分析和比较，最终确定阳性判断值为“BMPR1A基因≥5.5%或当4.0%≤BMPR1A基因<5.5%，PLAC 基因≥10%为阳性;BMPR1A基因<4%或当4.0%≤BMPR1A基因<5.5%，PLAC基因<10%为阴性”。

　　(五)稳定性研究

　　申请人对该产品的稳定性研究包括货架效期稳定性、运输稳定性、使用稳定性(包括开瓶稳定性、冻融稳定性)及样本稳定性(包括血清、血清提取DNA及提取转化后DNA的稳定性)。货架有效期稳定性：将三批试剂盒置于规定储存条件下放置0、3、6、7 个月，每到一个时间节点使用企业参考品对试剂盒的性能进行检测，结果显示试剂盒在生产后保存至7个月各项性能指标均符合产品技术要求，产品有效期可达6 个月。

　　此外，申请人对产品的运输稳定性、使用稳定性和样本稳定性分别进行了研究。结果显示，产品的性能均能满足产品说明书的声称。

三、临床评价概述

　　该产品在中山大学肿瘤防治中心、广州医奇亿娱乐学附属第一医院、解放绝总医院第三医学中心三家临床试验机构进行临床试验，采用试验体外诊断试剂与临床参考标准进行比较研究，确认本产品的临床性能。其中，原发性肝癌和其他肿瘤病例采用病理诊断确诊，其他疾病根据相关诊疗指南将病理诊断与影像学、血清学标志物结合综合判断。入组病例包括肝细胞癌、肝内胆管癌、混合型癌、其他常见癌种、肝脏良性疾病(肝囊肿、病毒性肝炎、脂肪肝、肝硬化等)，临床试验入组病例还包括依据非侵入性方法无法进行明确诊断的肝脏疾病人群。临床试验样本类型为血清。

　　产品临床灵敏度和特异度评价共纳入临床病例1503例，其中，非侵入性方法无法进行明确诊断的肝脏疾病病例96例，其中肝癌病例542例，非肝癌的其他病例979例(包括其他易产生干扰的肿瘤及各种良性疾病病例)。试验结果显示：本产品临床灵敏度为95.42%(95%CI：93.63%～97.21%)，特异度96.02%(95%CI：94.79%～97.24%)。上述结果显示试验体外诊断试剂具有较好的临床灵敏度和特异度，满足临床使用需求。

　　另外，采用试验体外诊断试剂对56例肝癌患者手术前后的样本进行连续检测，所有病例术前检测结果为阳性，术后检测结果为阴性，表明肝癌手术切除后血浆中甲基化水平降低。综上所述，临床试验结果显示本产品的临床性能满足技术审评要求。

四、产品受益风险判定

　　奇亿娱乐参照YY/T0316-2016《医疗器械风险管理对医疗器械的应用》对医疗器械产品的安全风险分析方式，对BMPR1A/PLAC8基因甲基化检测试剂盒(数字PCR法)进行风险分析。

　　(一)受益评估

　　该产品适用于临床上疑似原发性肝细胞癌、混合型癌的辅助诊断，包括临床肝区影像学检查和既有临床检查怀疑肝区占位性病变的患者，不能作为肿瘤早期诊断或确诊的依据，不宜用于普通人群的肿瘤筛查，检测结果阳性不作为肝癌临床确诊的唯一依据，检测结果阴性也不能排除肝癌的可能。其临床应用的主要受益在于：该产品为患者提供一种原发性肝癌辅助诊断方法的选择。该试剂盒对原发性肝细胞癌、混合型癌诊断的临床灵敏度为95.63%，特异度为96.07%。总符合率为95.02%。

　　(二)风险评估

　　根据申请人提供的申报资料，通过对该产品从生产原材料、配制、检测、包装、运输、储存、使用方法及安全注意事项、保存和用后处理等全过程危害判定、风险估计、预防化解，从产品技术要求和使用说明书及企业规章制度对产品质量的全过程控制和风险防范措施，已将产品的安全风险系数降到了验收准则规定的可接受范围内，同时采取降低风险的措施后没有引入新的风险。经综合评价，在目前认知水平上，认为该产品上市带来的受益大于风险。该产品已知和可预见的安全风险主要有以下几个方面：

　　1.与预期用途有关的安全风险，例如该产品不能用于肝内胆管癌的辅助诊断，不能作为肝癌早期诊断或确诊的依据，需结合其他的检查结果综合判断。不宜用于普通人群的肿瘤筛查。

　　2.与储存或运输有关安全风险，例如在不正确的储存和运输条件下储存、运输试剂盒。

　　3.与使用有关的安全风险，例如使用仪器和试剂时没有按照说明要求进行操作。

　　4.生物危险，例如使用后或失效的产品直接丢弃或产品使用过程中产生的废弃物未按照医疗器械废物统一销毁处理。尽管目前认为该产品的受益大于风险，但是为保证用械安全，基于对主要剩余风险的防控，已在该试剂盒说明书中提示以下信息：

　　1.预期用途

　　本试剂盒用于体外定性检测人血清中游离DNA(cfDNA)中的BMPR1A和PLAC8基因甲基化水平。

　　本产品适用于临床上对疑似原发性肝细胞癌、混合型癌的辅助诊断，包括临床肝区影像学检查和既有临床检查怀疑肝区占位性病变的患者，检测结果阳性不作为肝癌临床确诊的唯一依据，检测结果阴性也不能排除肝癌的可能。该检测不能作为肝癌早期诊断或确诊的依据，不宜用于普通人群的肿瘤筛查。

　　2.警示及注意事项：该试剂盒说明书奇亿娱乐确了该试剂盒检查方法的局限性及使用中的注意事项。